HBeAg gen bölgesinin Saccharomyces cerevisiae’da ekspresyonu

PDF Dosyası: 

arastirmax_1602_pp_91-93.pdf

Giriş
Hepatit B virüsü (HBV) üzerinde, tanımlandığı günden bu yana çok yoğun çalışmalar yapılmıştır ve geliş-
tirilen serolojik yöntemler ile bu virüsün neden olduğu
enfeksiyonların tüm dünyada ne denli yaygın olduğu
ortaya konmuştur. Günümüzde çoğunluğu gelişmekte
olan ülkelerde olmak üzere 350 milyondan fazla insanın HBV taşıyıcısı olduğu tahmin edilmektedir (1,2).
Taşıyıcılığın belirlenmesinde kullanılan serolojik gösterge hepatit B virüsünün yüzey antijeni (HBsAg) iken,
buna eşlik eden hepatit B virüs “e” antijen (HBeAg)
varlığı genellikle virüsün aktif replikasyonu olarak kabul edilmektedir (1). HBeAg varlığı genç taşıyıcılarda
yetişkin taşıyıcılara göre daha yüksek iken, anti-HBe
prevalansı ise yaşla birlikte artış göstermektedir (2).
HBV genomunun kor bölgesine ait iki açık okuma
bölgesi (“Open Reading Frame”; ORF) bulunmaktadır
ve eğer sentez Pre-C kısmında yer alan Adenin Urasil
Guanin (AUG) başlangıç kodonundan başlarsa 212
amino asidlik bir translasyon ürünü ortaya çıkmaktadır ve bu ürün HBeAg’nin öncülü (p25) olan bir moleküldür (1,2). Akut olgularda serumda HBeAg, HBsAg
ile hemen hemen aynı dönemde belirir ve HBsAg’den
önce kaybolur. HBeAg’nin kaybolması ve özellikle
spesifik antikoru olan anti-HBe’nin ortaya çıkması
(HBeAg/Anti-HBe serokonversiyonu) hastalığın iyileş-
meye doğru gittiğinin kanıtı olarak kabul edilmektedir
(1). Hem HBeAg, hem de anti-HBe serolojik yöntemlerle saptanabilmektedir. Hepatit B virüsünün üretilmesi
pratikte mümkün olmadığından, antijenik yapıların
elde edilmesinde daha çok rekombinant DNA teknolojisi kullanılmaktadır. Bu teknoloji sayesinde HBV’nin
antijenik proteinleri değişik sistemlerde ekspresyon
yoluyla bol miktarda üretilebilmektedir (3).
Bu çalışmada HBV DNA’sı pozitif hasta serumlarından PCR yöntemiyle çoğaltılan HBeAg gen bölgesinin
pYES2.1 TOPO TA ökaryotik ekspresyon vektörüne
yerleştirilerek bu antijeni eksprese edecek maya hücrelerine transformasyonu amaçlandı.
* GATF Viroloji Bilim Dalı
** GATF Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
*** TSK Sağlık Komutanlığı
Ayrı basım isteği: Dr. Kenan Şener, GATF Viroloji Bilim Dalı,
Etlik-06018, Ankara
E-mail: tabipks@yahoo.com
Makalenin geliş tarihi: 16.04.2009 • Kabul tarihi: 27.05.200992 • Haziran 2009 • Gülhane Tıp Derg Yapar ve ark.
Gereç ve Yöntem
HBeAg gen bölgesinin elde edilmesi: Klonlanacak PCR
ürünlerinin elde edilebilmesi amacıyla HBeAg’ye
özgü primerlerin dizaynı, GenBank’ta bulunan HBV
komple genom dizilerinden 97 tanesi referans alı-
narak kendi yazılımımız olan OligoYap 4.0 isimli bilgisayar programı aracılığıyla hazırlandı (4).
HBeAg için “sense” primer (1812. baz) olarak 5’
CCATGCAACTTTTTCACCTCTGCC 3’ ve “antisense”
primer (2457. baz) olarak 5’ AGTTTCCCACCTTATGA
GTCCAAGG 3’ dizileri tespit edilerek sentezlettirildi
(MWG, Almanya). Rutin tanı laboratuvarımızda HBV
yönünden pozitif bulunan hasta serumlarından elde
edilen DNA’lar kullanılarak PCR işlemi daha önce tanımlandığı şekilde yapıldı (5). PCR sonrası yapılan
agaroz jel elektroforezinde elde edilen amplikonlara
ait bandlar jelden kesilerek “Invisorb Spin Rapid PCR
Kit” (Invitek-Almanya) ile üretici firmanın önerileri
doğrultusunda pürifiye edildi.
Ekspresyon vektörünün hazırlanması ve kompetan bakteriye aktarılması: HBeAg gen bölgesine ait PCR ürünlerinin plazmid vektörüne klonlanması için pYES2.1 TOPO
TA ekspresyon kiti (Invitrogen, ABD) kullanıldı. Üretici
firma önerileri doğrultusunda PCR amplikonundan 4
μl, tuz solüsyonundan 1 μl, TOPO vektöründen 1 μl
karıştırılıp oda ısısında 5 dakika bekletildi. Elde edilen
rekombinant vektör CaCl
2
metodu ile hazırlanan kompetan bakteriye (TOPO 10F’ Escherichia coli) transforme
edildi (6). Transformasyon sonrası bakteriler 100 μg/ml
ampisilin içeren LB (Luria Bertni) agar [%1 tryptone
(Merck/Almanya), %0.5 yeast extract (Difco/ABD), %1
NaCl (Merck/Almanya), 15 gr/lt agar (Difco/ABD)-steril
distile su içinde] plaklara yayılarak ekildi. İnkübasyon
sonrası üreyen kolonilerden Plasmid Mini Kit (Qiagen,
Almanya) kullanılarak, üretici firma önerileri doğrultusunda yoğun plazmid (120 μg/ml) izolasyonu yapıldı.
Bu plazmidlere pYES 2.1+HBeAg adı verildi. HBeAg gen
bölgesine ait PCR ürünlerinin klonlama bölgelerine girip girmediğini kontrol etmek için, “sense” primer vektör üzerindeki “GAL1 forward priming site” alanından,
“antisense” ise amplikon üzerinden seçilerek, kit kullanma kılavuzunda belirtilen reaksiyon koşullarında
PCR işlemi yapıldı.
Ekspresyon vektörünün kompetan mayaya transformasyonu: Bu işlem için S.c. EasyComp Transformation
Kit (Invitrogen, ABD) kullanıldı. Önce Saccharomyces
cerevisiae’ya ait tek koloni YEPD (Yeast Extract Peptone
Dextrose) [%1 yeast extract (Difco/ABD), %2 pepton
(Merck/Almanya), %1 glukoz (Sigma/Almanya)-steril
distile su içinde] sıvı besiyerine ekildi ve spektrofotometrik olarak ölçülen 600 nm dalga boyundaki optik
dansite (OD600
) değeri 1 olana kadar 30
o
C’de inkübe
edildi (7). Daha sonra kitin kullanma kılavuzunda belirtildiği şekilde, hazırlanan kompetan maya hücrelerine transformasyon işlemi yapıldı ve maya hücreleri urasil içermeyen SC-U besiyeri (Urasil içermeyen
SC besiyeri) [%0.67 yeast nitrojen base (Invitrogen/
ABD), %2 glukoz (Sigma/Almanya), %0.01 adenin–
arjinin–sistein–lösin–lizin–treonin–triptofan (Sigma/
Almanya), %0.005 aspartat–histidin–izolösin–metiyonin–fenilalanin–prolin–serin–tirozin–valin (Sigma/
Almanya), %2 agar (Difco/ABD)-steril distile su içinde]
plaklarına ekilerek 30
o
C’de inkübe edildi. Normalde
urasil geni olmayan mayalar bu ortamda üreyemezken, vektörü alan mayalar vektör üzerindeki urasil
geni sayesinde bu ortamda üreyebildi. Bu nedenle
üreyen koloniler transformant olarak değerlendirildi
(7). Transformantlar %20 galaktoz (Sigma/Almanya)
içeren sıvı indüksiyon besiyerine ekildi. Vektör üzerinde bulunan GAL1 promoteri sayesinde besiyerindeki galaktoz transkripsiyonu indükledi ve üreyen
mayalar, klonlanmış geni eksprese edebildi (8).
HBeAg ekspresyonunun kontrolü: Sıvı indüksiyon
besiyerinde üreyen mayaların parçalanması daha
önce tanımlanan şekilde yapıldı (9). HBeAg antijeninin maya tarafından eksprese edilip edilmediğini
araştırmak için parçalanmış maya ekstresi 3000 g’de
5 dakika santrifüj edildi. Üst sıvı başka bir tüpe alı-
narak 1000 kat sulandırıldı ve rutin hepatit tanı laboratuvarımızda bulunan mikropartikül enzim immunassay prensibiyle çalışan Abbott Axsym System
(Abbott/Almanya) ve kemiluminesen mikropartikül
immunassay prensibiyle çalışan Architect i2000 SR
(Abbott/Almanya) isimli iki farklı otomatize cihazda
HBeAg varlığı yönünden test edildi.
Bulgular
HBeAg primerleriyle yapılan PCR işlemi sonrasında
agaroz jelde 670 bp ile uyumlu bölgede amplikonlara
ait bant görüntüsü elde edildi (Şekil 1a). Bu amplikonların ekspresyon vektörüne yerleştirilmesiyle elde
edilen pYES2.1+HBeAg plazmidinin kontrolü için yapılan PCR işlemi sonrasında agaroz jel elektroforezinde beklendiği gibi 774 bp ile uyumlu bölgede amplikonlara ait bant görüntüsü elde edildi (Şekil 1b).
Rutin hepatit seroloji laboratuvarımızda kullanılan
Abbott Axsym System (Abbott/Almanya) ve Architect
i2000 SR (Abbott/Almanya) cihazları ile parçalanmış
mayaların bulunduğu solüsyonda HBeAg varlığı araş-
tırıldı ve her iki cihazda da reaktif (>1000 mIU/ml),
yani pozitif sonuçlar elde edildi.
Tartışma
Hepatit B virüsüyle ilgili çalışmalar daha çok rekombinant DNA teknolojisi üzerinde yoğunlaşmıştır.
Hepatit B virüsünün kodladığı antijenlerin hem klonlama hem de ekspresyon vektörleri kullanılarak çoğaltılması mümkündür. Klonlanan gen bölgelerine ait
translasyon ürünlerinin ekspresyonu için prokaryotik Cilt 51 • Sayı 2 HBeAg geninin mayada ekspresyonu • 93
veya ökaryotik sistemler kullanılmaktadır. Ancak prokaryotik sistemlerde ekspresyon sonrası posttranslasyonel modifikasyonlar kısıtlıdır. Bu nedenle daha çok
ökaryotlar tercih edilmektedir (10-12). Bu çalışmada
da hepatit B virus “e” antijen gen bölgesinin pYES2.1
TOPO®
TA ekspresyon vektörüne klonlanması ve maya
hücrelerine (S.cerevisiae) transforme edilerek eksprese
edilmesi sağlandı.
Rekombinant DNA teknolojisi son 30 yıldır yoğun
olarak kullanılan bir teknoloji olup, ülkemizde de yapılmış pek çok çalışma mevcuttur. Özellikle HBV ile
ilgili yapılmış benzer çalışmalar vardır ve bunlar konu
ile ilgili bilgi birikiminin artması yönüyle önemli çalış-
malardır (5,11,12). Kaynakların kısıtlı olması ve farklı
merkezlerdeki deneyimlerin bir araya getirilmesindeki
zorluklar nedeniyle mevcut bilgi birikimlerinin tanı
kitleri, aşı ve tedavi amaçlı ürünler gibi ülke ekonomisine hissedilir seviyede katkı sağlayacak ürünlere dö-
nüşmesi kısıtlı olmuştur.
Hepatit B enfeksiyonu ile ilgili serolojik testler hem
tanı, hem de tarama amaçlı olarak birinci basamak sağ-
lık hizmeti veren kuruluşlar da dahil olmak üzere pek
çok sağlık merkezinde ve kan bankacılığında oldukça
sık kullanılmaktadır. Kullanılan serolojik ve molekü-
ler testlerin büyük çoğunluğu ithal ürünlerdir ve ülke
ekonomisine hatırı sayılır bir yük getirmektedir. Bu
nedenle sahip olunan bilgi birikiminin literatüre katkı
sağlama çabası yanında, kendi öz kaynaklarımızla elde
edilecek ürünlere dönüşmesi için kullanılması ülkemiz
bilim insanları üzerine düşen bir görevdir. Bu çalışmanın, hepatit B enfeksiyonlarının tanısında kullanılacak serolojik ve moleküler tanı kitlerinin geliştirilmesi
amacıyla planlanmış çok merkezli bir projenin parçası olması ve yukarıda sözü edilen nedenlerden dolayı
önemli olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmanın klonlama ve ekspresyon ile ilgili pratik deneyimlerimizi
artırdığı düşünülmektedir. Kullandığımız pYES2.1
TOPO®
TA ekspresyon vektörü HBeAg gibi proteinlerin
ekspresyonu için kullanımı kolay ve verimli bir vektör
olarak değerlendirildi. Ekspresyonun bir ökaryot olan
mayada yapılmış olması, elde edilecek proteinin tanısal
amaçlı hazırlanacak kitlerde kullanılabilmesine imkan
tanımaktadır. Sonuçta HBeAg üreten maya hücreleri
elde edildi ve sonraki çalışmalarda üretilen proteinlerin pür olarak elde edilmesi planlanmaktadır.