Anjiyogenezde bir in-vivo model: civciv koriyoallantoik membran

PDF Dosyası: 

arastirmax_1636_pp_67-69.pdf

Anjiyogenez ve modelleme
Anjiyogenez (neovaskülarizasyon) embriyogenez
döneminde baskın olarak, yetişkinlerde ise fizyolojik
damar yeniden oluşum sürecinde ve bazen de tümör
gelişimi ve diyabetik retinopati gibi bazı patolojik
olaylarda önemli bir rol oynamaktadır (1). Bu nedenle, anjiyogenez çalışmaları aktif bir araştırma alanıdır.
Gelecek dekadlarda anti- veya pro-anjiyojenik tedavilerden fayda görecek insan sayısının 500 milyonun
üzerinde olacağı düşünülmektedir (2). Kan damarı
oluşumu, birçok hücre tipinin ve çok sayıda molekü-
lün katıldığı kompleks ve çok basamaklı bir süreçtir.
Anjiyogenez, süreci pozitif ve negatif etkileyen moleküller arasındaki dengeye bağlı kontrol edilir. Bu konsept, “anjiyojenik anahtar (switch)” olarak adlandırılır
(3). Pozitif etkili pro-anjiyojenik moleküller, eğer baskın hale gelirse anjiyogenez süreci tetiklenir ve yeni
damar oluşumu meydana gelir. Dokuların ve moleküllerin heterojenitesini ve anjiyojenik reaksiyonların
hücresel karmaşıklığını düşündüğümüzde, araştırma
açısından tamamıyla yeterli tek bir ölçüm yönteminin
optimal şartları karşılamasının mümkün olamayacağı
açıktır. Bu nedenle, araştırma amaçlı birçok in vitro
ve in vivo anjiyogenez çalışma modeli önerilmiştir.
Anjiyogenez süreciyle ilgili in vitro modeller önemli
bilgiler sunmakla birlikte, in vivo etkinin ne olacağını
tam olarak gösteremez. Anjiyogenez araştırmalarında
kullanılan in vivo modellerin bir kısmı, tarama amaçlı
kullanılırken, diğerleri doz-etkinlik, moleküler yapısal
aktivite ve birden çok ajanın anjiyogenez üzerine kombine etkilerini araştırmak için kullanılmaktadır (2).
Anjiyogenezde kullanılan başlıca in vivo modeller:
 Civciv koriyoallantoik membran modeli (CAM)
 Tavşan kornea modeli (“micropocket”)
 Rodent mezenter modeli
 Sünger (“Sponge”) implant modeli
 Matrijel ve klasik tümör modeli
 Zebrabalık modeli
* GATF Biyokimya ve Klinik Biyokimya Anabilim Dalı
Bu makale, VII. Ulusal Klinik Biyokimya Kongresi’nde (19-22 Nisan 2007,
Antalya) poster bildiri olarak sunulmuştur
Ayrı basım isteği: Dr. Taner Özgürtaş, GATF Biyokimya ve Klinik Biyokimya
Anabilim Dalı, Etlik–06018, Ankara
E-mail: tozgurtas@gata.edu.tr
Makalenin geliş tarihi: 14.06.2007 • Kabul tarihi: 17.01.200868 • Mart 2009 • Gülhane Tıp Derg Özgürtaş
Ancak uygulanması en kolay, basit, tekrarlanabilir ve
anjiyojenik cevabın kantitatif ölçümüne imkan veren
çalışma modellerinin CAM ve tavşan kornea yöntemleri olduğu kabul edilmektedir (4,5). Anjiyogenezde
tarama amaçlı ve en çok kullanılan modellerin CAM,
tavşan kornea ve matrijel modelleri olduğu bildirilmektedir (6).
İdeal anjiyogenez çalışma modelleri aşağıdaki ihtiyaç-
ları karşılamalıdır:
 Anjiyojenik/anti-anjiyojenik ajanın salıverilme
oranı (“release rate”) tahmin edilebilmelidir
 Model, yeni damar oluşumunun kantitatif öl-
çümüne imkan sağlamalıdır (vasküler uzunluk,
volüm, damar ağındaki damarların sayısı, bazal
membranın genişliği gibi)
 Model, yeni damarın fonksiyonel karakteristiklerinin ölçümünü sağlamalıdır (Endotel hücresi
migrasyon, proliferasyon oranı, tüp oluşum oranı, kan akım oranı ve vasküler permaabilite gibi)
 Yeni oluşan damarlarla var olan damarlar kolayca ayırt edilebilmelidir
 Yeni damar oluşumuna neden olabileceği için
doku hasarlanmasından kaçınılabilmelidir
 Herhangi bir in vitro yanıt, modelde in vivo olarak gösterilebilmelidir.
 Model, uzun süreli ve noninvaziv monitörizasyona izin vermelidir
 Aynı zamanda yöntem, maliyet uygun, hızlı,
kolay uygulanabilir, tekrarlanabilir ve güvenilir
olmalıdır
Yukarıda sayılan nedenler dikkate alındığında, CAM
modeli uygun bir in vivo model olarak, kanser davranışlarının ortaya konmasında, biyomateryallerin etkilerinin incelenmesinde, fotodinamik tedavi yaklaşımlarında ve en son olarak anjiyogenezde sıklıkla kullanılan uygun bir model olarak karşımıza çıkmaktadır
(7). Aslında CAM modeli, 1956’dan bu yana metastaz
ve kanser çalışmalarında kullanılmaktadır. Folkman
tarafından 1976 yılında anjiyogenez çalışmalarında
kullanılmaya başlanmıştır (8). CAM ekstraembriyonik
bir membran olup, hem anjiyogenez hem de anti-anjiyogenez çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. CAM’ın civciv için fizyolojik önemi, gaz alış-veri-
şinde majör solunumsal organ olması ve atık ürünler
için mesane görevi görmesidir (9).
CAM’da anjiyogenez, gelişimsel olarak 3 safhadan
oluşur:
 Erken faz (5. günden 7. güne kadar)
 Ara faz (8. günden 12. güne kadar)
 Geç faz (12. veya 13. günden itibaren)
Erken fazda, kapiller ağ filizlenmeye başlar. Ara fazda, mikrovasküler ağda gelişim öne çıkar, filizlenme
bu aşamada sona erer. Son fazda, koriyoallantoik öğeler tam bir koruyucu membrana dönüşür ve genişlemesi tamamlanır. CAM modelinde, uygulamaların 5.
günden itibaren yapılabileceğini savunanlar olduğu
gibi (10), damarlanmanın olgunlaştığı 12. günden
sonraki dönemin uygulamalar açısından daha iyi
bir zamanlama olduğunu ifade edenler de vardır (7).
Uygulamaların 18. güne kadar yapılabilmesi mümkündür ancak, bu günden sonra embriyonun yeterince büyümesi ve hareketlerinin artması, uygulamaları
olumsuz etkilemektedir.
CAM uygulamalarının dezavantajları
Bu çalışmaların en temel kısıtlaması, nonspesifik
inflamasyon reaksiyonlarıdır. Fiziksel ve kimyasal
travma hücresel hasarlanmaya ve inflamasyonun
tetiklenmesine neden olur. Bu nedenle travma bazlı ölçümler, çalışmanın duyarlılığını ve özgüllüğünü
düşürür. Bu nedenle, inflamatuvar süreçlerden ka-
çınmak ve uzak durmanın gerekliliği açıktır. Bunlar
bazen yumurtanın kırık kabuk parçalarından dahi
başlayabilir, o yüzden mümkün olduğunca temiz çalışılması önerilir (Şekil 1).
Bir diğer kısıtlama, gerçek neovaskülarizasyonun
artmış vasküler dansiteden ayırt edilme güçlüğüdür.
Aynı zamanda, gelişmeleri görüntüleme güçlükleri de
çalışmaları zorlaştırmaktadır.
Uygulama sonrası değerlendirmelerin yapılacağı zaman konusunda da çeşitli farklı fikirler olmasına kar-
şın, eğer anjiyojenik bir ajan deneniyorsa 72-96 saat
sonra değerlendirmenin aksine, anti-anjiyojenik bir
ajan deneniyorsa 48 saat sonra sonuçları değerlendirmenin uygun olduğu kabul edilmektedir (8).
Bir diğer konu ise, kabuk kırıldıktan sonra havayla
temasın çok iyi bir şekilde önlenmesi ve izolasyonudur. Sonuçların değerlendirileceği döneme kadar ka-
Şekil 1. Koriyoallantoik membranda inflamatuvar süreci tetikleyecek
kırık kabuk parçası (GATF Biyokimya ve Klinik Biyokimya AD
Araştırma Laboratuvarı CAM çalışmaları arşivinden alınmıştır)Cilt 51 • Sayı 1 Anjiyogenez modeli • 69
bukta açılan pencerenin izolasyonunun bozulmaması gerekir, çünkü hava basıncı değişiklikleri uygulama
sonuçlarını etkileyebilir (2) (Şekil 2).
CAM uygulamalarının avantajları
Bu modelde çalışmanın en temel avantajları arasında, çalışma yapılacak döllenmiş yumurtaların temininin ucuz ve kolay oluşu gelmektedir. Ayrıca, bu model üzerinde yapılacak çalışmaların hayvan etik kurul
onayı gerektirmemesi bir diğer avantajdır.
Bu modelle yapılan çalışmalarda sonuçlara çok kısa
sürede ulaşmak mümkündür. Çalışma sonuçları gözle
rahatlıkla saptanabildiği gibi, uygun şartlarda fikse edilen preparatlarda ışık mikroskobundan elektron mikroskobuna kadar değişik duyarlılıkta histokimyasal ve
immünohistokimyasal değerlendirmeler yapılabilir.
Ayrıca fikse edilmeyen örneklerde, DNA ve kollajen öl-
çülmesi mümkün olduğu gibi, istenirse gen ekspresyonunun gösterilmesi amacıyla ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) çalışılabilir (Tablo I).
Bu modelin temel tıp branşları dışında, göz branşı
tarafından da (a) yeni cerrahi aletlerin ve tekniklerin
uygulanmasında, (b) damar kanül ve enjeksiyon tekniklerinin araştırılmasında, (c) anjiyografik çalışmalarda, (d) endoskopik cerrahi uygulamalarda da rahatlıkla
kullanılan bir model olması ayrı bir önem taşır (7).
Anjiyogenez konusunda in vivo model olarak bir-
çok yaklaşım mevcuttur. Bunlar içinde CAM modelinin temini, ucuzluğu, çalışma sonuçlarını değerlendirme kolaylığı yanında, güvenilir ve tekrarlanabilir
olması önem arz etmektedir. Ülkemizin araştırma
olanakları da göz önüne alındığında, civciv CAM modelinin anjiyogenez çalışmalarında en uygun model
olduğu değerlendirilmektedir. Bu modeli kullanarak
yaptığımız bazı çalışmaların sonuçları bildiri olarak
sunulmuştur (11-14).