Asthenozoospermia olgularında sperm morfolojisi değerlendirmede Spermac ve Diff-quik boya yöntemlerinin karşılaştırılması

PDF Dosyası: 

arastirmax_2174_pp_23-26.pdf

Giriþ
Günümüzde yardýmcý üreme tekniklerinin hýzlý bir
geliþme göstermesi ile infertilite nedenleri daha fazla
araþtýrýlmaya baþlanmýþtýr. Eskiden sadece kadýn odaklý
* Zonguldak Karaelmas Üniversitesi Týp Fakültesi Histoloji ve
Embriyoloji AD
** Dokuz Eylül Üniversitesi Týp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji
AD, Ýzmir
***Dokuz Eylül Üniversitesi Týp Fakültesi Kadýn Hastalýklarý ve
Doðum AD, Üremeye Yardýmcý Tedavi Merkezi, Ýzmir
Bu çalýþma Dokuz Eylül Üniversitesi Araþtýrma Fon Saymanlýðý tarafýndan 99.3456.23 sayý ile desteklenmiþtir
Ayrý basým isteði: Dr. Elvan Ok, Zonguldak Karaelmas Üniversitesi Týp
Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji AD, Kozlu, Zonguldak
E-mail: elvanok@karaelmas.edu.tr
Makalenin geliþ tarihi: 04.07.2007
Kabul tarihi: 28.02.2008
Gülhane Týp Dergisi 2008; 50: 23-26
ARAÞTIRMA
© Gülhane Askeri Týp Akademisi 2008
Özet
Sperm hareket bozukluklarý (asthenozoopermia) erkek
infertilitesi nedenleri arasýnda önemli bir yer tutmaktadýr.
Asthenozoopermia olgularýnda hareket bozukluðuna sperm
morfolojisi bozukluklarý eklendiðinde infertilitenin daha da
arttýðý saptanmýþtýr. Bu çalýþmada 15 Kasým 2004 ile 5 Nisan
2005 tarihleri arasýnda Dokuz Eylül Üniversitesi Týp
Fakültesi Tüp Bebek Merkezi'ne baþvuran toplam 65 erkek
(sperm motilite bozukluðu olan 21 erkek ile motilite bozukluðu olmayan 44 erkek) çalýþma kapsamýna alýndý. Tüm
semen örneklerine sperm morfolojisi bakýsýnda Spermac ve
Diff-quik boya yöntemleri uygulandý. Ýncelenen 55 semen
örneðinde test sonuçlarý her iki boyada da uyumluluk gösterdi. Test sonuçlarý uyumlu olan 32 semen örneðinde
sperm morfolojisi her iki testte de normal bulunurken, 23
olguda morfoloji yüzdesi düþük bulundu. Geri kalan 10 olgunun ise 7'sinde sperm morfolojileri Diff-quik boya ile normal
yüzdede bulunurken, Spermac boya ile anormal bir yüzde
saptandý. Üç örnekte ise Spermac boya ile sperm morfolojisi normal sýnýrlarda gözlenirken, Diff-quik boya ile anormal sperm morfolojisine rastlandý. Yapýlan Mc Nemar istatistiksel deðerlendirmede her iki boya yönteminin de güvenilir olduðu saptandý. Sperm morfolojisi bakýsý için kullanýlan iki testin birbirine olan üstünlüðünün saptanmamasý
nedeniyle, bu testlerden ekonomik olanýnýn seçilerek
maliyetin düþürülmesi saðlanabilir.
Anahtar kelimeler: Asthenozoopermia, Diff-quik, Spermac,
sperm morfolojisi
Summary
Comparison of Spermac and Diff-quik staining methods in
the assessment of sperm morphology in asthenozoopermia
cases
Sperm motility problems (Asthenozoopermia) is one of the
major causes of male infertility. In cases with asthenozoopermia infertility increases to a greater extent when sperm
morphology disorders are added to coexisting motility disorders. A total of 65 males (21 males with sperm motility disorder and 44 males without this disorder) who referred to the
in vitro fertilization unit of Dokuz Eylul University Medical
School between November 15, 2004 and April 5, 2005 were
included in the present study. Spermac and Diff-quik staining
methods were used in the assessment of sperm morphology in
all semen samples. Test results showed consistency with both
staining methods on 55 semen samples examined. Sperm morphology was normal in 32 semen samples with consistent test
results by both methods, while the percentage of morphology was low in 23 cases. In 7 of remaining 10 cases, the
sperm morphology was in the normal range with Diff-quik
staining method while an abnormal percentage was detected
with Spermac method. In 3 cases the sperm morphology was
within normal limits with Spermac staining method while
Diff-quik staining method demonstrated abnormal sperm
morphology. Statistical analysis with Mc Nemar test demonstrated that both staining methods were reliable. Since neither of the two methods used in the evaluation of sperm morphology has proven superiority to the other, a cost reduction
may be provided by choosing the economical one.
Key words: Asthenozoopermia, Diff-quik, Spermac, sperm
morphology24 · Mart 2008 · Gülhane TD Ok ve ark.
olduðu düþünülen infertilite nedenlerinin son çalýþ-
malarda yarýdan fazla oranda erkek faktörüne baðlý
olduðu görülmüþtür (1).
Erkek infertilitesi ile ilgili yapýlan çalýþmalarda özellikle temel sperm parametrelerinin son derece önemli
olduðu görülmektedir. Asthenozoopermia veya düþük
sperm motilitesinin erkek infertilitesinde en sýk neden
olduðu bildirilmektedir (2).
Sperm morfolojisi de erkek infertilitesinde önemli
yer tutmaktadýr. Özellikle asthenozoopermia ile birlikte
olan sperm morfoloji bozukluklarý infertilitenin þiddetinin artmasýna yol açmaktadýr (2).
Sperm morfolojisinin infertilitede bu denli önem
taþýmasý sperm morfoloji deðerlendirmesini de doðru
bir þekilde yapma gereðini doðurmaktadýr. Morfoloji
deðerlendirmesi Kruger ve "World Health Organization" (WHO) kriterlerine göre yapýlmaktadýr. Son yýllarda Kruger kriterlerinin infertil hastanýn taný ve
tedavisini deðerlendirirken daha anlamlý bilgiler verdiði
kabul edilmektedir (3-5).
Tüp bebek merkezlerinde sperm morfoloji boyasý
için rutinde kullanýlan iki boya bulunmaktadýr: Diffquic ve Spermac boyalarý. Bu çalýþmada bu iki boya
yönteminin sonuçlarý karþýlaþtýrýlarak, sperm morfolojisini göstermede boyalarýn birbirine üstünlüðü olup
olmadýðýnýn gözlenmesi amaçlanmýþtýr.
Gereç ve Yöntem
Olgular: Dokuz Eylül Üniversitesi Týp Fakültesi
Kadýn Hastalýklarý ve Doðum Anabilim Dalý Tüp Bebek
Merkezi'ne 15 Kasým 2004 ile 5 Nisan 2005 tarihleri
arasýnda baþvuran toplam 65 olgu (sperm motilite
bozukluðu olan 21 olgu ile motilite bozukluðu olmayan
44 olgu) çalýþma kapsamýna alýndý.
Kontrol grubunun yaþ ortalamasý 34.4 yýl ve yaþ
aralýðý 24-45 yýl idi. Motilite bozukluðu olan grubun ise
ise yaþ ortalamasý 34.6 yýl ve yaþ aralýðý 24-52 yýl idi.
Olgularýn infertilite süreleri ise 24 aydý.
Semen analizi: Semen örnekleri mastürbasyon yöntemi ile 4 günlük ideal cinsel perhiz sonrasý elde edildi.
Mastürbasyonla elde edilen semen örneði steril ve geniþ
aðýzlý bir kapta toplandý.
Semenin likefaksiyonu için 30 dakika beklendi. Tüm
olgulara makroskobik deðerlendirme yapýldýktan sonra
mikroskobik deðerlendirme ile sperm sayýsý, motilitesi
ve morfolojisi deðerlendirildi. Mikroskobik deðerlendirme faz kontrast mikroskobu ile yapýldý.
Sperm konsantrasyonu ve motil sperm yüzdelerinin
belirlenmesi için Makler Sayým Kamerasý kullanýldý.
Semen örnekleri 37 °C'de bekletildi ve motilite
deðerlendirmesi ejakülasyondan sonra 1 saat içinde oda
sýcaklýðýnda yapýldý. Sperm konsantrasyonu ve motil
sperm yüzdesi WHO kriterlerine göre belirlendi. Her
semen örneðinde 200 sperm sayýldý. Her bir spermin
motilitesi 4 kategoride skorlandý: a) Hýzlý ileri hareketli
b) Yavaþ ileri hareketli c) Yerinde hareketli d) Hareketsiz
(immotil).
Mikroskop alanýný lineer motilite ile geçen spermler
ileri hareketli olarak deðerlendirildi. Lineer motilitesi
olmayan spermlerle, lineer motilitesi olan spermlerin
toplam yüzdesi ise toplam hareketlilik olarak belirlendi.
Ejakülasyondan sonra 60 dakika içinde %50 ve daha fazla ileri motilitesi (hýzlý ileri hareketli+yavaþ ileri hareketli) veya %25'den fazla hýzlý ileri motilitesi olan örnekler sperm hareketliliði açýsýndan normal kabul edildi.
Sperm morfolojisi bakýsýnda Diff-quik (DiffQuick®, Allegiance Healthcare Corp., USA) ve Spermac boyalarý (Stain Interprise, Willington) kullanýldý.
Toplam 65 olgunun semen örnekleri her iki boya yöntemi ile boyandý.
Deðerlendirme 1000X büyütmede yapýldý. Boyanan
her örnekte 200 sperm sayýldý ve Kruger kriterlerine
göre deðerlendirme yapýldý. Yüzde 5'in üzerinde normal
formu olan semen örnekleri morfolojik açýdan normal
kabul edildi.
Kruger kriterlerine göre bir spermin normal olarak
deðerlendirilebilmesi için sperm baþ, boyun ve kuyruk
bölümlerinin normal olmasý gerekmektedir. Baþ oval
olmalý ve boyu 4-5 µm, geniþliði ise 2.5-3.5 µm
olmalýdýr. Akrozomal bölge, baþ bölgesinin %40-70'ini
kaplamalýdýr. Orta kýsým, ince ve uzun olmalý ve orta
kýsmýn geniþliði 1 µm'den az, boyu baþ uzunluðunun
1.5 katý olmalýdýr. Kuyruk ise düz ve kývrýlmamýþ
olmalýdýr. Kuyruðun yaklaþýk uzunluðu 45 µm olmalýdýr. Kruger kriterlerine göre bu sýnýrlamalarýn dýþýndaki tüm deðerler anormal kabul edilmektedir (6,7).
Diff-quik boyama yöntemi ile toplam orta parça
anomali yüzdesi ortalamasý ve toplam kuyruk defekti
yüzdesi ortalamasý hesaplandý. Bu ortalama hesaplanýrken hareketliliði düþük olan ve sperm parametreleri
normal olan grubun toplam orta parça ve kuyruk anomali yüzdesi toplamý ayrý ayrý hesaplanarak örnek sayýsý-
na bölündü.
Diff-quik boya: Diff-quik boya kiti, 1 adet fiksatif ile 2
adet boyadan oluþmaktadýr. Boyalardan biri eosin, diðeri
ise azure solüsyonu içermektedir.
Diff-quik boyama prosedürü: Yaymalar önce Diff-quik
fiksatifinde fikse edildi. Daha sonra sýrayla solüsyon 1 ve
2'de 5'er saniye bekletilerek boyandý. Üçüncü adým sonrasý lamlar deiyonize su ile yýkandý ve böylelikle fazla
boya uzaklaþtýrýldý. En son lamlar kapatýcý ile kapatýldý
(6,7).Cilt 50 · Sayý 1 · Gülhane TD Asthenozoospermia ve sperm morfolojisi · 25
Spermac boya: Spermac boya kiti, 1 adet fiksatif ile 2
adet boyadan oluþmaktadýr.
Spermac boyama prosedürü: 1 damla semen lama
yayýldý. Lam fiksatife kondu ve fiksatifte 5 dakika bekletildi. Sonra preparat bir saat kadar havada kurutmaya
býrakýldý. Bir kap içinde bulunan distile suya 7 kez
daldýrýlarak yýkandý. Fazlasý kurutma kâðýdý ile alýndý ve
biraz kurumasý beklendi. Kuruyan preparatlar sýrasýyla
A boyasýnda 2 dakika, B ve C boyalarýnda ise birer dakika tutuldu ve her boyadan sonra distile suya daldýrýlarak
yýkandý. Preparatlar havada kurumaya býrakýldý ve 100
büyütmede immersiyon yaðý ile incelendi (7).
Sonuçlarýn Mc Nemar testi ile yapýlan istatistiksel
deðerlendirmesinde (8) anlamlý bir farklýlýk bulunmadý
(p=0.09).
Bulgular
Ýncelenen 55 örnekte Diff-quik ve Spermac boyalarýnýn test sonuçlarý paralellik gösterdi. Test sonuçlarý
paralellik gösteren 32 olguda sperm morfolojisi her iki
testte de normal bulunurken, 23 olguda morfoloji
yüzdesi düþük bulundu (Tablo I). Geri kalan 10 olgunun ise 7'sinde sperm morfolojileri Diff-quik boya ile
normal yüzdede bulunurken, Spermac boya ile anormal
bir yüzde saptandý. Üç olguda ise Spermac boya ile
sperm morfolojisi normal sýnýrlarda gözlenirken, Diffquick boya ile anormal sperm morfolojisine rastlandý
(Þekil 1 ve Þekil 2).
Yapýlan istatistiksel deðerlendirmede her iki testin de
güvenilir olduðu saptandý.
Sperm hareketliliði normal olan 44 olgu ile sperm
hareketliliði düþük olan 21 olguda sperm morfolojisi
bakýlýrken, Diff-quik boyama yöntemi ile toplam orta
parça anomali yüzdesi hesaplandý. Toplam orta parça
defekti yüzdesi ortalamasý, hareketliliði düþük olan
olgularda kontrol grubuna göre iki kat daha yüksek
oranda bulunurken (%9 ve %18), toplam kuyruk defekti yüzdesi ortalamasý 0.6 kat daha yüksek bulundu
(%21.3 ve %34.8).
Tartýþma
Günümüzde yardýmcý üreme tekniklerinin yaygýnlaþmasý ile infertilite nedenleri daha çok araþtýrýlmakta
ve fertilizasyonda önemli rolü olan sperm morfolojisi
birçok çalýþmada yer almaktadýr.
Sperm morfolojisi bozukluklarý ile sperm motilitesi
arasýnda anlamlý ve yakýn iliþki olduðunu vurgulayan bir
çalýþmada morfolojik bozukluðun lokalizasyonunun
motiliteyi etkileyebileceði gösterilmiþtir (9).
Üremeye yardýmcý tedavi merkezlerinde sperm morfoloji bakýsý için genellikle hýzlý boyama teknikleri kulTablo I. Diff-quik ve Spermac boya yöntemleri ile sperm morfolojisi bakýlan semen örneklerinde, normal ve anormal sperm
morfolojisi saptanan örneklerin sayý ve yüzdeleri
_______________________________________________________________________________________________________________________
Sperm morfolojisi bakýlan semen örneði
____________________________________________________
Normal Anormal Toplam
________________________________________________________________________________________________________________
Her iki boyama yöntemi Sayý % Sayý % Sayý %
ile paralel sonuç Diff-quik 32 58.19 23 41.81 55 100
alýnanlar Spermac 32 58.19 23 41.81 55 100
________________________________________________________________________________________________________________
Sonuçlarýn uyumsuz Sayý % Sayý % Sayý %
olduðu olgular Diff-quik 7 70 3 30 10 100
Spermac 3 30 7 70 10 100
____________________________________________________________________________________________________________________________
Boyama yöntemi
Þekil 1. Bir asthenozoopermia olgusunda baþ, orta parça, kuyruk
anomalisi gözlenen sperm (Diff-quik boyasý, X1000)
Þekil 2. Bir normozoospermia olgusunda normal morfolojide
bir sperm (Spermac boyasý, X1000)26 · Mart 2008 · Gülhane TD Ok ve ark.
lanýlmaktadýr. Bunlardan özellikle Diff-quik ve
Spermac boyalarý sýk kullanýlan boyalardýr. Çok hastasý
olan merkezlerde testlerin hem hýzlý sonuç vermesi,
hem de güvenilir olmasý büyük önem taþýmaktadýr.
Günümüzde sperm morfoloji deðerlendirmesini
standart hale getirmek ve optimum doðruluðu saðlamak
için genellikle katý Kruger kriterleri kullanýlmaktadýr.
Normal morfoloji yüzdesini hesaplamada likefiye
semen spermatoza kaynaðýný oluþturmaktadýr (10).
Kruger ve ark. 1987 yýlýnda çift kör yöntemi ile 2
teknisyen tarafýndan 20'þer semen örneðinin morfolojik
deðerlendirme sonuçlarýný incelemiþler ve Papanicolaou boyasý ile Diff-quik boyama sonuçlarý arasýnda
anlamlý bir farklýlýk görmemiþlerdir (11).
Literatürde yapýlan bir baþka çalýþmada semen
örneðinin yýkanmasýndan önce ve sonrasýnda 2 boya
arasýnda mükemmel bir korelasyon olduðu gösterilmiþtir (12). Ancak bu çalýþma 20 semen örneði üzerinde
yapýlmýþtýr. Bizim çalýþmamýz ise 65 örnek üzerinde
çalýþýlmýþtýr ve sonuçlarýmýz bu çalýþmayý destekler niteliktedir.
Graves ve ark.nýn 2005 yýlýnda yaptýklarý bir çalýþmada laboratuvarda çalýþanlarýn yapmýþ olduklarý sperm
morfoloji bakýsý deðerlendirilmiþ ve %7.3'den %15'e
kadar deðiþen normal form yüzdeleri saptanmýþtýr (13).
On ayrý laboratuvarýn sperm konsantrasyonu, sperm
motilitesi ve canlýlýðýný deðerlendiren bir baþka çalýþmada ise motilite ve canlýlýk açýsýndan teknisyen deðerlendirmelerinde anlamlý farklýlýklar saptanmýþtýr (14).
Bu farklýlýk, testlerin farklý teknisyenlerce uygulanmasýndan kaynaklanmýþ olabilir. Çalýþmamýzda tüm
uygulama aþamalarýnýn ve özellikle de boyanmýþ
preparatlarýn deðerlendirme aþamasýnýn tek bir kiþi
tarafýndan (Dr. Elvan Ok) yapýlmýþ olmasý sonuçlarý
daha güvenilir kýlmaktadýr.
Yapýlan çalýþmalar incelendiðinde sperm orta parça
uzunluðunun kontrol gruplarýna göre asthenozoospermik olgularda belirgin olarak kýsa olduðu (15), açýklanamayan asthenozoopermia olgularýnda yapýlan bir baþka
çalýþmada da periaksonemal anomalilerle aksonemal
defektlerin sýký iliþkide olduðu ve azalan motilitede
aksonemal anomalilerin tek neden olmadýðý gözlenmiþtir (16). Çalýþmamýzda ise Diff-quick boya ile morfolojik baký yapýlýrken toplam orta parça defekti yüzdesi
ortalamasý, hareketliði düþük olan olgularda kontrol
grubuna göre iki kat daha yüksek oranda bulunurken
(%9 ve %18), toplam kuyruk defekti yüzdesi ortalamasý
0.6 kat daha yüksek bulundu (%21.3 ve %34.8). Basit ve
noninvaziv bir yöntem olan semen analizi ile de
asthenozospermia olgularýnda mikroskobik olarak orta
parça ve kuyruk defektlerinin fazla gözlenmesi bu olgularýn tanýnmasýný daha da önemli kýlmaktadýr.
Sonuç olarak sperm morfoloji bakýsý için kullanýlan 2
testin birbirine herhangi bir üstünlüðünün saptanmamasý nedeniyle, bu testlerden ekonomik olanýn seçilerek maliyetin düþürülmesi saðlanabilir.
Teþekkür
Makalenin istatistiksel deðerlendirilmesinde katkýda bulunan Illinois State Üniversitesinden Doç. Olcay Akman'a ve
Dokuz Eylül Üniversitesi Týp Fakültesi Tüp Bebek Merkezi
çalýþanlarýna teþekkür ederiz.