Bevakizumab ve Pegaptanip sodyum'un civciv koryoallantoik membrandaki in vivo anjiyogenez üzerine etkisi
Giriþ
Anjiyogenez veya yeni damar oluþumu embriyogenez sýrasýnda temel olaylardan birisidir. Embriyogenez dýþýnda, yetiþkinlerde anjiyogenez çok sýnýrlý
olaylarda; yaralanma sonrasý doku tamiri ve menstrüyel
siklus sýrasýnda görülmektedir. Anjiyogenez bazen de
tümör geliþimi, psöriyazis ve koroid neovaskülarizasyon
gibi bazý patolojik olaylarda önemli bir rol oynamaktadýr
(1). Bu nedenle, anjiyogenez konusu aktif bir araþtýrma
alanýdýr. Kan damarý oluþumu, birçok hücre tipinin ve
çok sayýda molekülün katýldýðý kompleks çok basamaklý
bir süreçtir. Ýn vitro modeller bu süreçle ilgili önemli
bilgiler sunmakla birlikte, in vivo etkinin ne olacaðýný
tam olarak gösteremez. Anjiyogenez araþtýrmalarýnda
çok yaygýn olarak kullanýlan ve oldukça faydalý bir in
vivo model, civciv koryoallantoik membran (CAM)
modelidir.
* GATF Göz Hastalýklarý AD
**GATF Biyokimya ve Klinik Biyokimya AD
Bu çalýþma, 41. Ulusal Türk Oftalmoloji Derneði Kongresi'nde (Antalya,
30 Ekim-2 Kasým 2007) poster bildiri olarak sunulmuþtur
Ayrý basým isteði: Dr. Taner Özgürtaþ, GATF Biyokimya ve Klinik Biyokimya AD, Etlik-06018, Ankara
E-mail: tozgurtas@gata.edu.tr
Makalenin geliþ tarihi: 29.11.2007
Kabul tarihi: 28.02.2008
Gülhane Týp Dergisi 2008; 50: 19-22
ARAÞTIRMA
© Gülhane Askeri Týp Akademisi 2008
Özet
Bu çalýþmanýn amacý, yaþa baðlý maküla dejenerasyonunun
tedavisinde sýkça kullanýlan iki preparatýn (Pegaptanip
sodyum ve Bevakizumab) anti-anjiyojenik etkinliðini civciv
koryoallantoik membran modelinde göstermektir. Çalýþmada, Atak-S cinsi tavuklardan alýnan döllenmiþ yumurtalar
kullanýldý. Yumurtalar uygun nem ve sýcaklýk þartlarý altýnda uygulamanýn yapýlacaðý 5. güne kadar bekletildi. Daha
sonra Pegaptanip sodyum ve Bevakizumab'ýn farklý konsantrasyonlarý yumurtalara uygulandý ve sonuçlar deðerlendirilinceye kadar uygun koþullarda saklandý. Sonuçlar,
uygulama sonrasý 48. saatte deðerlendirildi. Her iki ilacýn
da insanlarda yaþa baðlý maküla dejenerasyonundaki olumlu etkilerine raðmen, civciv koryoallantoik membran modelinde anti-anjiyojenik etkileri gözlenmedi. Bu sonuçlarýn
seçilen ilaç dozlarýnýn yetersizliðinden veya insan ve civciv
damar endotelinin büyüme faktörü izoformlarýnýn farklý
özelliklerinden kaynaklanmýþ olabileceði düþünülmüþ ve bu
nedenle daha detaylý çalýþmalara ihtiyaç olduðu sonucuna
varýlmýþtýr.
Anahtar kelimeler: Anjiyogenez, anti-anjiyojenik etki,
VEGF
Summary
The effects of Bevacizumab and Pegaptanip sodium on in
vivo angiogenesis in chick chorioallantoic membrane
The purpose of this study was to demonstrate the antiangiogenic efficacy of the two agents (Pegaptanip sodium
and Bevacizumab), which are commonly used in the treatment of age-dependent macula degeneration in chick
chorioallantoic membran model. Fertilized eggs obtained
from Atak-S type chicken were used. The eggs were kept
under appropriate heat and humidity until the fifth day on
when the application would be performed. Pegaptanip sodium and Bevacizumab were applied to eggs at different concentrations, and the eggs were kept under an appropriate
condition until the evaluation of the results. Results were
evaluated at the 48th hour after application. Although both
of the two agents have affirmative effects on age-dependent
macula degeneration in humans, they did not have any antiangiogenic effects in chick chorioallantoic membran model.
These findings may have resulted from inadequate doses of
drugs chosen or from different features of human and chick
vascular endothelial growth factor isoforms, and thus, more
detailed studies are needed to perform.
Key words: Angiogenesis, anti-angiogenic effect, VEGF20 · Mart 2008 · Gülhane TD Durukan ve ark.
Anjiyogenez, süreci pozitif ve negatif etkileyen
moleküller arasýndaki dengeye baðlý kontrol edilir.
Pozitif etkili pro-anjiyojenik moleküller, eðer baskýn
hale gelirse anjiyogenez süreci tetiklenir ve yeni damar
oluþumu meydana gelir. Bu konsept, "anjiyojenik
anahtar (switch)" olarak adlandýrýlýr (2). Damar
endotelinin büyüme faktörü (VEGF) majör pro-anjiyojenik faktördür. VEGF'in asýl fonksiyonu, endotel
hücrelerinin yaþam sürelerini uzatmasý, endotel hücrelerinin proliferasyonu, migrasyonu ve invazyonunu
artýrarak anjiyogenezi desteklemektir (3).
VEGF düzeylerinin artýþý anjiyogenezi artýrýcý yönde
etkili olmaktadýr. Bu nedenle, VEGF düzeylerinin
baskýlanmasý anti-anjiyojenik etki oluþturmaktadýr. Bu
amaçla üretilen ve "American Food and Drug Administration" (FDA) tarafýndan onaylanan ilk preparat
Bevakizumab'dýr (Avastin®). Son zamanlarda bir diðer
VEGF preparatý olan Pegaptanip sodyum'un da olumlu
etkilerine iliþkin çok sayýda yayýn bulunmaktadýr (4,5).
Bu çalýþmada, farklý etki mekanizmalarýna sahip iki
anti-VEGF preparatýnýn etkinliðini civciv koryoallantoik membran modelinde karþýlaþtýrmayý amaçladýk.
Gereç ve Yöntem
Bevakizumab solüsyonunun hazýrlanýþý: 100 mg/4 ml
Bevakizumab (Altuzan®, Roche®) preparatýndan farklý konsantrasyonlarda (40, 60 ve 120 µg) çalýþma solüsyonlarý hazýrlandý.
Pegaptanip sodyum solüsyonunun hazýrlanýþý: 0.3 mg /90
µg Pegaptanip sodyum (Macugen®, Pfizer®) preparatýndan 75 µg'lýk çalýþma solüsyonu hazýrlandý.
CAM ölçümü: CAM ölçümlerinin tamamý GATF
Biyokimya AD Araþtýrma Laboratuvarýnda yapýldý.
Atak-S cinsi döllenmiþ yumurtalar, Tavukçuluk
Entitütüsünden (Ankara, Türkiye) saðlandý ve deney
boyunca 37
o
C, %85-90 nemli ortamda inkübe edildi.
Bevakizumab ve Pegaptanip sodyum uygulamasý için, 5
günlük yumurtalar sýrasýyla 14 ve 28'li gruplar halinde
ayrýldý ve çalýþma solüsyonlarý uygulandý. Anjiyogeneze
iliþkin deðiþiklikler, uygulamadan 48 saat sonra literatürde belirtildiði þekilde koryoallantoik membran
üzerinde deðerlendirildi ve digital kamera kullanýlarak
görüntüler kaydedildi (Konica Minolta, Tokyo, Japan)
(6).
Bulgular
Doza baðlý ilaç etkinliðini göstermek üzere preparatlarýn farklý konsantrasyonlarý beþ günlük CAM'a uygulandý (Þekil 1). CAM'daki anjiyogenezle ilgili deðiþiklikler 48 saat sonra deðerlendirildi. Bevakizumab ve
Pegaptanip sodyum'un farklý konsantrasyonlardaki
solüsyonlarý ile muamele edilen CAM örneklerinde
anti-anjiyojenik etkinlik gözlenmedi (Þekil 2).
Tartýþma
Ýlk defa 1983 yýlýnda Senger ve ark. tarafýndan "tumor
vascular permeability factor" (VPF) olarak tanýmlanan
proteinin, 1989 yýlýnda Ferrara ve Henzel tarafýndan
izole edilerek amino asid dizisi ortaya konan "vascular
endothelial growth factor" (VEGF) ile ayný molekül
olduðu anlaþýlmýþtýr (7). Bundan sonra, VEGF ile ilgili
çok sayýda çalýþma yapýlmýþtýr.
VEGF, homodimerik yapýda bir glikoprotein olup,
vasküler endoteliyal hücrelere spesifiktir (8). Bir çok
büyüme faktörü anjiyogenezde rol oynarken, VEGFA'nýn diðerlerinden farklý kritik bir rolü vardýr. VEGF
gen ailesinin diðer üyeleri; VEGF-B, VEGF-C, VEGFD ve plasenta kaynaklý büyüme faktörüdür (PIGF).
VEGF-A'nýn en az dört adet izoformu bulunmaktadýr;
VEGF121, VEGF165, VEGF189 ve VEGF206 (8,9). Bu
Þekil 1. Civciv koryoallantoik membran ölçümünde kullanýlan
döllenmiþ yumurtalar
Þekil 2. Pegaptanip uygulamasý öncesi ve sonrasý (A, C), Bevakizumab uygulamasý öncesi ve sonrasý (B, D)Cilt 50 · Sayý 1 · Gülhane TD Anti-VEGF ajanlarýn CAM'a etkisi · 21
formlar içinde VEGF165 en çok ifade edilen izoformdur (10).
Yaþa baðlý maküla dejenerasyonu (YBMD) ve diyabetik retinopati gibi bazý göz hastalýklarýnýn patogenezinde, VEGF-A'nýn rol oynadýðýna dair çok sayýda
insan ve hayvan çalýþmalarý bulunmaktadýr (11,12). Ek
olarak, YBMD'li hastalarýn koroidal neovasküler membranlarýnda yüksek konsantrasyonda VEGF-A düzeylerine rastlanmýþtýr (13).
FDA tarafýndan YBMD'de tedavi amaçlý onaylanmýþ
iki ilaçtan birisi olan Pegaptanip sodyum bir aptamerdir.
Etkisini, VEGF-A'nýn en fazla bulunan izoformu
VEGF165'e baðlanýp VEGF165'in spesifik reseptörüne
baðlanmasýný bozarak yapmaktadýr (5). Pegaptanip
sodyum'la yapýlan en büyük çalýþma olan "VEGF
Inhibition Study in Ocular Neovascularization
(VISION)" çalýþmasý, bu preparatýn kullanýmýnýn gü-
venli ve sonuçlarýnýn etkili olduðunu göstermektedir
(14). Biz de bu nedenle, çalýþmamýzda Pegaptanip
sodyum'un CAM üzerindeki etkinliðini göstermek ve
anjiyogenez sürecine katkýsýný deðerlendirmeyi amaç-
ladýk. Ancak, yukarýda bahsedilen büyük katýlýmlý çalýþ-
malardaki olumlu sonuçlarýn aksine, Pegaptanip
sodyum'un CAM üzerinde anti-anjiyojenik etkinliðini
saptayamadýk. Bizim çalýþmamýzda, preparatýn farklý
konsantrasyonlarýný deneme imkanýmýz olmadýðý için
daha yüksek veya daha düþük dozlardaki etkilerini
deðerlendiremedik. Biz de bulduðumuz sonuçlarý
yorumlarken seçilen dozun anti-anjiyojenik etkinlik
için yeterli olmayabileceðini düþündük.
FDA tarafýndan 2004 yýlýnda anti-anjiyojenik etkinliði nedeniyle ilk defa onaylanan preparat olan
Bevakizumab ise, baþlangýçta metastatik kolon kanserlerinde kemoterapiyle birlikte kullanýlmak üzere planlanmýþ, ancak daha sonra YBMD ve maküla ödeminde
"off-label" olarak kullanýlmýþ ve baþarýlý sonuçlar
alýndýðý bildirilmiþtir (15,16). Bevakizumab, anti-VEGF
monoklonal antikoru olup, doðal antikorlarýn yüksek
baðlanma affinitesi ile VEGF-A'yý baðlamaktadýr. Bevakizumab da yapýlan kontrolsüz çalýþmalarda, YBMD
olgularýnda güvenle kullanýlabilecek ve etkin bir
preparat olarak bildirilmiþtir (15). Bevakizumab'ýn
etkinliðini biz de CAM'da göstermek istedik ve bu
amaçla farklý konsantrasyonlarýný hazýrlayarak uyguladýk. Sonuçlar deðerlendirildiðinde, Bevakizumab'ýn
da CAM üzerinde belirgin bir anti-anjiyojenik etkisini
gözlemlemedik. Bu yetersiz etkinin deney için seçilen
dozlarýn uyumsuzluklarýndan kaynaklandýðýný, ya da
insan VEGF'ine karþý afinitesi yüksek preparatlarýn civciv cinsinde yeterli özgüllüðe sahip olmamasýna baðlý
olabileceðini deðerlendirdik.
Sonuç olarak, CAM modeli YBMD için kullanýlabilecek uygun bir in vivo anjiyogenez modelidir. Diðer
biyolojik modellerde olduðu gibi, CAM'da anjiyojenik
amaçlý yapýlacak çalýþmalarýn da bazý dezavantajlarý
(non-spesifik inflamatuvar reaksiyon ve neovaskülarizasyonun dilatasyonla karýþabilmesi gibi) bulunmaktadýr. Ek olarak bu modelde, tür farklýlýklarýndan kaynaklanabilecek uyumsuzluklar da gözlenebilmesine rað-
men, bu modelle çalýþmak ucuz, basit, uygulama ve de-
ðerlendirmesi kolay bir yöntemdir. Çalýþma sonuçlarý
ile ilgili kesin kararý verebilmek için, daha geniþ kapsamlý ve daha farklý etken madde konsantrasyonlarýnýn
denendiði çalýþmalarýn gerekli olduðunu düþünmekteyiz.
Türkiye’nin ilk İşletme Fakültesi olan İstanbul Üniversitesi İşletme Fakültesi bir ilke daha imza atmaya hazırlanıyor. Arastirmax.com "1. Liselerarası İşletme ve Ekonomi Proje Yarışması"nın sponsorlarından biri olmaktan gurur duymakta.