Meme kanseri (MCF-7) ve Burkitt lenfoma (Raji) hücre dizileri üzerine in vitro ortamda hiperisin ile fotodinamik tedavi araştırma sonuçları

PDF Dosyası: 

arastirmax_2203_pp_147-152.pdf

Giriþ
Hiperisin, doðal bir fotosensitizör ve etkin bir protein kinaz C (PKC) inhibitörü olarak kötücül tümörlerin fotodinamik tedavisinde güncellik kazanmýþtýr (1).
Sistemik uygulama yaný sýra lokal uygulamaya olanak
vermesi nedeniyle, göz bu tedavinin uygulanabileceði
ideal bir ortam olarak görünmektedir (2).
Günümüzde fotodinamik tedavi (FDT) gözde ve göz
dýþý hastalýklarýn tedavisinde uygulanmaktadýr. Fotodinamik tedavide dolaþýmdaki ya da hedeflenen dokudaki fotosensitif boya uygun dalga boyu ile uyarýlýr ve
ortama salýnan serbest radikaller yoluyla vazooklüzyon
ve doku hasarý gerçekleþir (3). Bu maksatla, pek çok
vital boya laboratuVar ve klinik koþullarda denenmektedir.
Hiperisin doðada bilinen en etkin fotoaktif doðal pigmenttir (4). Ayrýca, etkin bir PKC inhibitörüdür. Halk
dilinde "sarý kantoron otu" olarak bilinen Hypericum perforatum'dan elde edilen bu doðal ilaç yaþlýlardaki
depresyonun tedavisinde, özellikle Orta Avrupa'da yýllardýr kullanýlmaktadýr. Sobacý ve ark. subfoveal
koroidal neovasküler membranýn tedavisi için hiperisin
ile güçlendirilmiþ Argon lazer fotokoagülasyon uygulayarak hiperisinin gözde fotodinamik maksatla kullanýlabileceðini göstermiþlerdir (5).
Çalýþmamýzda, daha sonra göz tümörlerinin
tedavisinde de uygulanýlmasý düþünülen bu yöntemin
kötücül hücrelere örnek olarak seçilen meme kanseri
(MCF-7) ve Burkitt lenfoma (Raji) hücre dizileri üzerine olan antitümöral etkinliði ve bu etkinlikte PKC
inhibisyonunun rolü araþtýrýlmýþtýr.
Gereç ve Yöntem
Bu çalýþma GATA Araþtýrma Merkezi'nde Þubat 2003
ile Mayýs 2003 tarihleri arasýnda yapýlmýþtýr. Meme
kanseri hücre dizisi MCF-7 ve Burkitt lenfoma hücre
dizisi Raji, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center,
NY'den temin edildi. MCF-7 ve Raji hücre dizileri %5
karbondioksid içeren ve 37 derecede olan ortamda
RPMI 1640 içinde kültüre edildi. RPMI 1640 vasatý ýsý
ile inaktifleþtirilmiþ sýrasýyla %10 ve %20’lik fetal dana
serumu içermektedir. Bunun dýþýnda 2 µM L-glutamin,
100 µg/ml streptomisin ve 100 u/ml penisilin
katýlmýþtýr. Hiperisin %0.1'lik dimethylsulfoxide
(DMSO) içinde çözündü ve kullanýmdan hemen önce
kültür ortamýnda (1-50 µM) dilüe edildi. Çalýþmadaki
DMSO konsantrasyonu %0.1'i geçmedi. DMSO'nun
olasý yan etkilerini kontrol etmek için, vasat bütün
deneylerde negatif bir kontrol olarak kullanýldý. Çalýþ-
mada kullanýlan bütün kimyasallar Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO'dan satýn alýndý. Hiperisinin MCF-
7 ve Raji hücre dizileri üzerine toksik etkilerini belirlemek üzere 1, 5, 10, 50 µM konsantrasyonlarýnda
hiperisin 24 ve 48 saat boyunca hücre dizileri ile 96
kuyucuklu plate içinde inkübasyona býrakýldý. Ayrýca,
baþka bir plate üzerinde ayný doz aralýðýnda hiperisin ve
ardýndan lazer uygulamasý yapýldý. Her iki plate
üzerinde 12'þer kuyucuk sadece kontrol ve sadece lazer
(pozitif) kontrol olarak kullanýldý.
Çalýþmamýzda 532 nanometre, yeþil dalga boyunda
ýþýn salan KTP YAG lazer (Orion™) kullanýldý. Lazer
enerji fluensi 24 jul/cm²'ye ayarlandý ve 12 mm çapýndaki lazer probu ile her defasýnda plate'deki bir kuyucuk
üzerinde tutularak lazer uygulandý. Bu testler ayný plate
üzerinde olmak üzere 5 kez tekrarlandý. Ardýndan MTT
[3-(4,5-dimethyl-thiazoyl)-2,5-diphenyl- SH-tetrazolium bromide] testi yapýldý.
MTT testi daha önce tanýmlandýðý gibi uygulandý
(6,7). Hedef tümör hücreleri; hücresel canlýlýklarýný tripan mavisi ile test edilerek deðerlendirildikten sonra 1-
x105
hücre/ml ortamýnda tekrar süspanse edildi. 100 µL
hücre süspansiyonu 96 kuyucuklu plate'in (Costar CO.,
Cambridge, MA) her bir kuyucuðuna daðýtýldý ve her
plate 24 saat inkübe edildi. Daha sonra istenen konsantrasyondaki 100 µL reagant solüsyonu her kuyucuða
daðýtýldý ve 24, 48, 72 saat tedavi uygulandý. Yalnýz 200
µL hücresiz vasat içeren kuyucuklar ve reagant'lar
negatif kontrol olarak kullanýldý. Belirtilen inkübasyon
zamanýndan sonraki tedaviyi takiben 20 µL MTT
solüsyonu (5 mg/mL ) her kuyucuða eklendi ve mikroplate'ler 37 derecede 4 saat daha inkübe edildi.
Kuyucuktaki reaksiyona girmeyen süpernatantlar
çýkarýldý ve 100 µL asidifiye izopropanol (0.04 N HCI
izopropanol içinde) kültürlere eklendi ve formazonun
koyu mavi kristalleri eriyinceye kadar karýþtýrýldý. Her
kuyucuðun absorbans deðeri (A) 570 nm filtre içeren
mikroplate ELISA okuyucu ile belirlendi. Negatif kontroller sýfýr absorbans deðeri olarak kullanýldý. Sonuçlar
belirlenen sitotoksisite yüzdesi (deneysel kuyucuðun 1-
A'sý/pozitif kontrol kuyucuðu) x 100 olarak sunuldu.
Her deney sunulan veriler doðrultusunda 3 kez tekrarlandý.
Apopitozun belirlenmesi için hücre siklus analizinden faydalanýlarak hücreler Giemsa ile boyandý.
Apopitotik hücreler literatürde belirtildiði gibi nükleer
yapýlarýnda oluþan deðiþiklikler (nükleus periferinde
kresent þeklinde kromatin yoðunlaþmasý ve/veya sitoplazmik tomurcuklanma) temel alýnarak tanýmlandý (8).
Apopitotik hücre oraný her deneysel gruptan 500 hücre
içinden belirlendi ve her deney 3 kez tekrarlandý.
Protein kinaz C yolaðý üzerinden apopitotik etkinin
oluþup oluþmadýðýný belirlemek için staurosporin 1 nMCilt 49 · Sayý 3 · Gülhane TD Kötücül hücrelerde fotodinamik tedavi · 149
konsantrasyonunda 48 saatlik inkübasyonda hiperisin
ve lazer ile birlikte ilave edildi. Ayný plate üzerinde
sadece staurosporin ilave edilen 12'þer kuyucuk ise pozitif kontrol olarak deðerlendirildi.
Ýstatistiksel deðerlendirmede Student's two-tailed ttesti saptanan farklýlýklarýn istatistiksel önemini belirlemek için kullanýldý ve bulunan deðerin p<0.05 olmasý
istatistiksel olarak anlamlý kabul edildi.
Bulgular
Çalýþmada elde edilen sonuçlar kontrol ve negatif
kontrol gruplarý ile karþýlaþtýrýlarak istatistiksel deðerlendirmeler yapýldý. Gereç ve yöntem bölümünde belirtildiði gibi kontrol grubu olarak alýnan sadece
hücrelerin üretildiði ve hiçbir iþleme tabi tutulmayan
kuyucuklar kontrol grubu olarak alýndý. Bu kuyucuklar
ile sadece lazer uygulanan kuyucuklar (pozitif kontrol)
arasýnda istatistiksel olarak anlamlý farklýlýk yoktu ve bu
sonuca göre sadece lazer uygulamasýnýn MCF-7 ve Raji
hücreleri üzerine bir etkisi saptanmadý. Lazer ýþýnlama
yapýlmadan 1-50 µM dozlarýnda sadece hiperisinin
hücre dizileri üzerine antiproliferatif etkisi gözlenmedi
(Þekil 1). Lazer ve hiperisin birlikte uygulanan MCF-7
ve Raji hücre dizileri 24. ve 48. saatlerde kontrol grubu
ile karþýlaþtýrýldýðýnda belirgin antiproliferatif etki
gözlendi (Þekil 2,3). Ýstatistiksel incelemelerde 24. saatte MCF-7 ve Raji üzerine artan konsantrasyonlarda
daha belirgin olmak üzere antiproliferatif etki saptandý
ve bu artýþ 50 µM hiperisin ile en belirgindi (Sýrasý ile;
p<0.001 ve p<0.001). Kýrk sekizinci saatte de MCF-7
ve Raji üzerine artan konsantrasyonlarda antiproliferatif
etki saptandý. Bu artýþ 10 ve 50 µM hiperisin ile en belirgindi (Sýrasý ile MCF-7: p<0.001 ve p<0.001; Raji:
p<0.05 ve p<0.01). Yüksek konsantrasyonda (50 µM)
hiperisin ile lazerin 24. ve 48. saatlerde MCF-7 üzerine
olan antiproliferatif etkileri Raji hücre dizisine göre
daha belirgindi. Ancak istatistiksel olarak anlamlý deðildi. Zamana baðlý olarak deðerlendirmede ise MCF-7 ve
Raji üzerine 24. ve 48. saatlerde artan konsantrasyonlarda antiproliferatif etkide anlamlý artýþ gözlendi (Sýrasý
ile; p<0.001 ve p<0.001). Kýrk sekiz saatlik tüm dozlarda hiperisin ve lazer inkübasyonunda PCK inhibitörü
staurosporin eklenip pozitif ve negatif kontrollerle
karþýlaþtýrýldýðýnda MCF-7 ve Raji üzerine antiproliferatif etkide belirgin derecede artýþ gözlendi (Sýrasý ile 50
µM'da; p<0.001 ve p<0.001) (Þekil 4). MCF-7 hücrelerinde daha belirgin olmak üzere apopitotik hücrelerde sitoplazmik tomurcuklanma, nükleer kondansasyon ve fragmantasyon izlendi (Þekil 5,6).
Hiperisin (µM)
MCF-7
Raji
1 5 10 50
120
100
80
60
40
20
0
% viabilite
Þekil 1. Tek baþýna hiperisin uygulamasýnýn 24 saatte hücre dizileri üzerine etkisi
Hiperisin (µM)
MCF-7
Raji
1 5 10 50
100
80
60
40
20
0
% viabilite
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
Þekil 2. Hiperisin ve lazer uygulamasýnýn 24 saatte hücre dizileri
üzerine etkisi
**
***
***
***
*
*
Hiperisin (µM)
MCF-7
Raji
1 5 10 50
100
80
60
40
20
0
% viabilite
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
Þekil 3. Hiperisin ve lazer uygulamasýnýn 48 saatte hücre dizileri
üzerine etkisi
** **
*
***
**
***
*
*
Hiperisin (µM)
MCF-7
Raji
1 5 10 50
100
80
60
40
20
0
% viabilite
** **
*
***
***
***
** **
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
Þekil 4. Hiperisin-lazer ve staurosporin kombinasyonunun 48
saatte hücre dizileri üzerine etkisi150 · Eylül 2007 · Gülhane TD Uysal ve ark.
Tartýþma
Günümüzde tümörlerin tedavisinde FDT yöntemlerinin uygulanmasýna yönelik çalýþmalarýn yoðunluk
kazandýðý izlenmektedir. Verteporfin ile yapýlan fotodinamik tedavi kötücül dokularýn tahrip edilmesinde
güvenilir bir yol olarak bildirilmiþtir (3).
Protein kinaz C aktivitesinin inhibisyonu ile birçok
tümör türünde hücrelerin büyümesinin inhibe edildiði
bilinmektedir. Ýn vitro çalýþmalarda hiperisinin tümör
hücreleri üzerinde antiproliferatif ve sitotoksik etki gösterdiði bildirilmektedir (9). Protein kinaz C aktivitesinin hiperisin tarafýndan inhibe edilmesi ile bazý tümör
gruplarýnda hücrelerde apopitozisin indüklendiði gösterilmiþtir (10). Bizim çalýþmamýzda da hiperisin etkisini PKC aktivitesini doza baðýmlý inhibe ederek göstermiþtir. Çalýþmamýzda hücrelerde apopitozun göstergesi
olan hücre sitoplazmasýnda tomurcuklanma, nükleer
kondansasyon ve fragmantasyon izlenmiþtir. Hiperisinin oluþturduðu fotoaktivasyonun hücre içi asidifikasyonun ve glutatyonun azalmasýna ve mitokondriyal
tahribata neden olduðu bildirilmiþtir (11). Bunlarda da
apopitotik morfolojik deðiþiklikler izlenmiþtir.
Fotodinamik ajanlarýn tümörler tarafýndan alýnma ve
birikme miktarýný tümör damarlarýnýn geçirgenlik farklarý belirler (12). Vandenbogaerde ve ark. hiperisinin
sitotoksik etkisini araþtýrdýklarý bir çalýþmada fototoksisitenin hiperisinin hücreler tarafýndan tutulma miktarý
ile orantýlý olduðunu göstermiþlerdir (13). Bizim çalýþ-
mamýzda da östrojen reseptörü pozitif meme kanseri
hücre dizisi MCF-7'de fototoksisite daha belirgindi. Bu
etkinlik MCF-7'de hiperisin toplanmasýnýn fazla olmasý
sonucu geliþmiþ olabilir. Bunun için daha ileri moleküler çalýþmalara gereksinim olduðu açýktýr.
Du ve ark. cilt altýna yerleþtirdikleri nazofaringeal
karsinomaya hiperisin ile fotodinamik tedavi uyguladýklarý zaman tümörün vasküler yapýsýnda tahribat ve
tümör hücrelerinin direkt ölümü sonucu tümör dokusunda nekroz ve küçülme meydana geldiðini bildirmiþlerdir (14). Ýyi diferansiye olmuþ tümörler az diferansiye olanlara göre hiperisinli fotodinamik tedaviden
daha fazla yarar görür. Hiperisinin kötücül tümör
yüzeyinde yeni bir epitel oluþturduðu görülmüþtür (9).
Liu ve ark. hiperisin ile KTP 532 yeþil lazer uygulamasýnýn in vivo ve in vitro ortamda pankreatik kanser
büyümesini azalttýðýný göstermiþlerdir (15). Biz de
çalýþmamýzda, hücre dizileri ile hiperisinin 1-50 µM
konsantrasyonlarda 24-48 saat süreyle inkübasyonunu
takiben KTP lazer uyguladýk. Doz ve süre arttýkça
meme kanseri ve Burkitt lenfoma hücre dizisi
üzerindeki sitotoksik etkinin arttýðýný gözlemledik.
Sadece lazer uygulanan grupta ise bu etki gözlenmedi.
Hiperisin intravenöz uygulamadan yarým saat sonra
plazmada pik konsantrasyonuna ulaþýr. Bu ayný zamanda tümör vasküler yapýlarýndaki pik konsantrasyon
zamanýdýr. Daha sonra hiperisin tümör dokusunda
toplanmaya baþlar ve dokudaki pik seviyesine ilaç
alýmýndan 6 saat sonra ulaþýr. Hiperisin ile fotodinamik
tedavi, vasküler yapýlarýn mikrovasküler oklüzyonu ile
etkinlik gösterdiðinden damar içinde en yüksek
düzeyde olduðu dönemde yani ilaç alýmýndan yarým
saat sonra uygulanmalýdýr (16).
Colasanti ve ark. prostatik adenokarsinoma ve prostatik adenokarsinomanýn lenf nodu metastazlý hücre
dizilerini 0.001-0.3 µgr/ml konsantrasyonlarda hiperisin
ile 24 saat inkübe ettikten sonra 599 nm dye lazer uyguladýklarý fotodinamik tedavi sonucunda hücrelerde
Þekil 5. May-Graunwald-Giemsa ile boyanmýþ meme kanseri
(MCF-7) hücre dizisi: Apopitozun göstergesi olan sitoplazmik
tomurcuklanma, nükleer kondansasyon ve fragmantasyon
izleniyor
Þekil 6. May-Graunwald-Giemsa ile boyanmýþ Burkitt lenfoma
(Raji) hücre dizisi: Saðlam hücreler ile sitoplazmasý tomurcuklanmýþ apopitotik hücreler izleniyorCilt 49 · Sayý 3 · Gülhane TD Kötücül hücrelerde fotodinamik tedavi · 151
toksik etki gözlediklerini, hiperisin kullanýlmadan
yapýlan lazer uygulamasýnda ise bu etkinin gözlenmediðini bildirmiþlerdir (17).
Chen ve ark.nýn bir çalýþmasýnda hiperisin ile fotodinamik tedavi uyguladýklarý hücre dizilerinde agaroz
jel elektroforez tetkiki ile nükleozomal DNA'da fragmantasyon ve ýþýk mikroskobi incelemesinde apopitozun hiperisin ile yapýlan fotodinamik tedavinin en
belirgin etkisi olduðu anlaþýlmýþtýr (18). Ayrýca tümör
hücrelerinin immünohistokimyasal analizinde Fas ve
Fas ligand artýþý saptanmasý bu hücre ölümü yolunun
fotodinamik tedavinin indüklediði apopitoza katký yapabileceðinin göstergesi olarak yorumlanmýþ ve hiperisin
ile fotodinamik tedavinin tümör eradikasyonunda
vasküler mikrooklüzyon yoluyla apopitoza neden
olduðu sonucuna ulaþmýþlardýr (18).
Hadjur ve ark. hiperisin ile fotodinamik tedavinin
melanoma hücre dizileri üzerinde sitotoksik etkiye
sahip olduðunu bildirmiþlerdir (19). Bu sonuç uvea
melanomlarýnda hiperisin ile fotodinamik tedavinin
etkili olabileceðini düþündürmektedir. Ayrýca retinal
kapiller hemanjiyomun tedavisinde baþarý ile kullanýlmýþtýr (2).
Hiperisin ile fotodinamik tedavide özellikle 590 nm
dalga boyunda lazer kullanýlarak tümörlerde 10 mm
derinliðe kadar etki gözlendiði bildirilmiþtir (20). Bu
intraoküler tümörlerin tedavisinde çýðýr açabilecek bir
geliþmedir. Araþtýrýcýlar benzer etkinin 532 nm dalga
boyunda da gözlendiðini ve fotodinamik tedavi ile
tümör nekrozunda sadece fotofiziksel etkilerin deðil
(ýþýk penetrasyon sayýsýna baðlý absorbe edilen atomlar)
vasküler yataktaki etkilerin de önemli olduðunu ortaya
koymuþtur. Hiperisin ile fotodinamik tedavinin uygulandýðý tümör hücreleri arasýnda mesane tümörleri de
bulunmaktadýr (20,21). Ayrýca bu tümörlerde fotodinamik tedavinin hiperisinin flöresans özelliði dolayýsý
ile izlenebilir olmasý çok belirgin bir klinik uygulama
avantajý sunmaktadýr (22,23).
Ritz ve ark. hiperisinin gliyoblastoma hücrelerinde
nöronlara göre daha fazla toplandýðýný ve gliyoblastoma
hücrelerinin hiperisin ile uygulanan fotodinamik
tedaviyle inaktive edildiðini bildirmiþlerdir (24). Çocukluk çaðýnda sýk görülen rabdomiyosarkom hücrelerine hiperisin ile inkübe edildikten sonra FDT uygulanmýþ ve apopitoz oranýndaki artýþla birlikte hücre çoðalmasýnýn neredeyse tamamen durduðu görülmüþtür
(25). Bu çalýþmalarda elde edilen etkiler hiperisin ile
lazerin beraber kullanýlmasý ile saðlanmýþtýr. Çalýþ-
mamýzda da lazer uygulamasý ancak hiperisin ile inkübe
edilen hücrelerde antiproliferatif etki göstermiþtir.
Östrojen reseptörü pozitif meme kanseri hücre dizisi
MCF-7'de hiperisin ile FDT'nin etkinliði ilk kez çalýþ-
mamýzda gösterilmiþtir. Hiperisinin intravenöz, oral,
intratümöral, topikal kullanýmlarý mevcuttur. Temini
kolaydýr ve ucuzdur. Argon-yeþil (514 nm) ve 532 nm
yeþil dalga boyunda fotoaktivasyon gösterdiði bilinmektedir. Bu bakýmdan pratikte yaygýn kullaným alaný bulabilir. Nitekim göz kapaðýnýn bazal hücreli karsinomunda hiperisinli FDT uygulandýðý bildirilmiþtir (9).
Sonuç olarak bu in vitro çalýþmamýz, gelecekteki in
vivo ve klinik çalýþmalara ýþýk tutabilecek özelliktedir.