Beş farklı protez kaide materyalinin gingival fibroblastlar üzerine olan etkilerinin incelenmesi
Giriþ
Akril reçinesinin polimerizasyonu,
yýllardýr araþtýrma konusu olmuþtur. Akril
reçinelerin diþ hekimliðinde kullanýma
girmesiyle birlikte kitlenin fiziksel özelliklerini daha da geliþtirebilmek, dokulara
uyumunu daha da mükemmel hale
getirebilmek ve kitle içinde oluþma ihtimali olan poroziteyi yok edebilmek için,
çeþitli polimerizasyon yöntemleri denen-276 · Aralýk 2005 · Gülhane TD Sipahi ve ark.
Chambridge, MA, USA) geçirildi.
Böylece, stok MTT hazýrlanmýþ oldu.
Hazýrlanan stok MTT kullaným süresi
yakýn olduðu için, deney gününe kadar
+4°C'de saklandý. Deney günü 48. ve
120. saatlerde, metaller kültür ortamýndan
alýndýktan sonra tripsinizasyon yapýlarak
hücreler döküldü. Tripsinizasyon yapýlan
hücreler 15'lik tüpler içine alýnýp santrifüj
edilip, hücrelerin dibe çökmesi saðlandý.
Doksan altý kuyucuklu doku kültür
kabýnýn (Costar, Chambridge, MA, USA)
en dýþýndaki kuyucuklara 200 µl DMEM,
ortadakilere ise solüsyon olarak hazýrlanmýþ hücrelerden 1x10
2
hücre/µL konsantrasyon konuldu. Daha önce hazýrlanmýþ olan stok MTT'den 5 mg/ml olacak
þekilde DMEM ile karýþtýrýlarak çalýþma
solüsyonu hazýrlandý. Yapýlan çalýþma
solüsyonundan 20 µl hücrelerin üzerine
ilave edildi. Doksan altýlýk doku kültür
kabý, 4 saat süreyle 37°C'deki inkübatörde
bekletildi. Dört saat sonra hücre kültü-
rünün bulunduðu herbir kuyucuktan 200
µl sývý steril pipetle alýndý ve 100 µl isopropyl (0.04 N HCl içinde) konuldu.
Doku kültür kabý, streç film ile sarýlýp
hava almasý önlendi. Dört saat süreyle,
oda ýsýsýnda karanlýkta bekletildi. Dört
saat sonunda Biotek firmasýnýn 540 nm’
lik mikroplate okuyucusunda (ELISA
Reader-EL312e, Bio-Tek, Vermont,
USA) MTT deðerleri okundu. Optik
okuyucudan elde edilen deðerler, aþaðýdaki denklem ile yüzde olarak hesaplandý.
Veriler, SPSS 10.0 paket programý
kullanýlarak deðerlendirilmiþtir. Ýstatistiksel analizde, student t testi ve istatistiksel
anlamlýlýk için 0.05 düzeyi kullanýlmýþtýr.
Bulgular
Bütün test örneklerinden elde edilen
hücre canlýlýk sonuçlarý Þekil 1'de görülmektedir. Kýrk sekizinci saatte elde edilen
hücre canlýlýðýnýn 120. saate göre daha az
olduðu görülmektedir. Test örnekleri
içinde en fazla toksisiteye sahip test
örneði, kimyasal olarak polimerize olan
akrilikte bulunmuþtur (%75-%78). Bunu
sýrasýyla, ýsý ile polimerize olan (%80-
%82), enjeksiyonla polimerize olan (%83-
%84), ýþýnla polimerize olan (%86-%89)
ve mikrodalga ile polimerize olan (%88-
%90) akriller izlemektedir. Kontrol
grubuna göre bütün test örneklerinde,
Gereç ve Yöntem
Test örneklerinin hazýrlanmasý: Test
edilen örnekler, Tablo I'de gösterilmiþtir.
Herbir test örneði, üçer tane olacak þekilde, steril þartlarda yapým kurallarýna
uygun olacak þekilde üretildi. Bütün
kaide materyalleri, muflada (5 mm çap x
0.5 mm kalýnlýk) boyutlarýnda hazýrlanan
mum örneklerden elde edildi. Polimerizasyon iþlemi Tablo I'de gösterildiði gibi
yapým kurallarýna uygun olacak þekilde
gerçekleþtirildi. Örnekler, hücre kültü-
rüne konulmadan önce %70 etanol ve
steril su ile yýkanýp kurutuldu.
Hücre kültürünün oluþturulmasý: Çalýþ-
mamýza, periyodontal olarak saðlýklý,
ortodontik çekim endikasyonu olan
yaþlarý 14 ile 26 arasýnda deðiþen (ortalama 20.64±3.6 yýl) 15 hasta alýndý. Bu
hastalarýn onayý alýndýktan sonra, çekim
soketinden epitelsiz bað dokusu örnekleri
alýndý. Yüz ml RPMI (Biological Industries, 1640, Kibbutz Beit Haemak, Israel)
ile 1 ml penisilin ve streptomisinden
hazýrlanan taþýma solüsyonundan 5 ml,
steril tüpler içine konularak örnekler laboratuvara getirildi. Doku örnekleri, laboratuvarda steril petri kabýna alýnarak
taþýma solüsyonu ile iki defa yýkandý.
Yýkama iþleminden sonra steril 20 numaralý bistüri kullanýlarak doku örnekleri
küçük parçalara ayrýldý. Küçük parçalara
ayrýlan doku parçacýklarý 25 cm2
'lik doku
kültür kaplarýna (flasklara) aktarýldý.
Doku kültür kaplarýnýn üzerini kaplayacak þekilde 3 ml besiyeri DMEM
(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,
Biological Industries, 25115, Kibbutz Beit
Haemak, Israel) ilave edildi. Doku kültür
kabýnýn aðzý hafif açýlarak, %5'lik CO2
,
37°C'deki inkübatöre (Sanyo, Japan)
hücrelerin üremesi için konuldu. Üç
günde bir, hücre kültür besiyeri tazelendi.
Hücrelerin üremesi, Invert ýþýk mikroskobu (Zeiss, West Germany) kullanýlarak kontrol edildi. Hücreler flaskýn
yaklaþýk 1/4'ünü doldurduklarýnda, içindeki 3 ml'lik besiyeri alýndý. TripsinEDTA'nýn (Biological Industries, 25115,
Kibbutz Beit Haemak, Israel) 1.5 ml
solüsyonu kabýn içine boþaltýldý. Beþ dakika 37°C'lik inkübatörde hücrelerin
yapýþtýklarý kap yüzeyinden kalkmalarý
beklendi. Hafif pipetaj yapýlarak hücrelerin birbirinden iyice ayrýlmasý saðlandý.
Doku kültür kabýnýn içine 3 ml'lik
DMEM besiyeri aktarýldý ve TripsinEDTA'nýn aktivitesi DMEM besiyeri ile
inhibe edilmiþ oldu. Yirmi dört saat sonra
flask içindeki besiyerinin tamamý alýnarak
3 ml yeni besiyeri eklendi. Devam eden
günlerde, 3 günde bir besiyeri deðiþtirildi.
Hücreler flask yüzeyinin en az 3/4'lük kýsmýný kapladýðýnda, gingival fibroblast
hücre kültürü elde edilmiþ oldu.
Gingival fibroblast hücre kültürü elde
edildikten sonra, 24'lük doku kültür
kabýnýn (Costar, Chambridge, MA, USA)
her bir kuyucuðuna 1x10
4
hücre gelecek
þekilde hücrelerin ekimi yapýldý. Test
örnekleri de hücre ekimi yapýlmýþ 24'lük
doku kültür kabýnýn her bir kuyucuðunun ortasýna gelecek þekilde yerleþtirildi.
Herbir test örneði, üçer kez test edildi.
Muamele edilmemiþ kültür, kontrol
grubu olarak kullanýldý.
Hücre canlýlýk testinin yapýlmasý: Bu
iþlem, test örneklerinin 48. ve 120. saatlerinde kültür ortamýndan alýnmasýndan
sonra yapýldý. Yapýlan iþlemler karanlýk
ortamda ve oda ýsýsýnda gerçekleþtirildi.
Ýþleme baþlamadan önce 50 mg MTT (3-
(4,5-dimethyl-thiazoyl)-2,5-diphenylSH-tetrazolium bromide) (Sigma M2128
St.Louis, MO, USA), 10 ml DMEM
içerisinde çözülerek 5 mg/ml'lik MTT
solüsyonu hazýrlandý. Çözülen MTT
solüsyonu, 0.2 µ'lik filtreden (Costar,
Tablo I. Test edilen protez kaide akrilleri
______________________________________________________________________________
Polimerizasyon yöntemi Ticari ismi (Üretici firma) Sertleþme süresi
______________________________________________________________________________
Kimyasal polimerizasyon Rebase (Tokuyama) Oda ýsýsýnda 1 saat
(Soðuk akril)
Isý ile polimerizasyon Lucitone199 (Dentsply) 70 ºC, 9 saat
(Sýcak akril)
Iþýkla polimerizasyon Triad (Dentsply) Görülebilir ýþýk, 10 dakika
Enjeksiyonla polimerizasyon Palajet/Palaxpress (Heraeus, 55 ºC, 30 dakika
Kulzer)
Mikrodalgayla polimerizasyon Acron MC (GC Corp) Mikrodalga fýrýný, 3 dakika
______________________________________________________________________________Cilt 47 · Sayý 4 · Gülhane TD Protez kaide materyali ve gingival fibroblastlar · 277
istatistiksel olarak farklýlýk görülmüþtür
(p<0.05). Test örneklerinin birbirleri ile
olan karþýlaþtýrmasýnda ise mikrodalga,
enjeksiyon ve ýþýnla polimerize olan
akriller, ýsýyla ve kimyasal olarak polimerize olan diðer test örneklerine göre istatistiksel olarak farklýlýk göstermiþtir
(p<0.05) (Þekil 1).
Tartýþma
Ülkemizde rutin olarak kullanýlan
farklý akrillerin ve bu akriller içinde bulunan elementlerin gingival dokularý ne
þekilde etkilediði konusunda kapsamlý bir
çalýþma bulunmamasý göz önüne alýnarak,
bu konudaki eksikliðin giderilmesi amacýyla planlanan bu araþtýrmada, toksisiteye
zamana baðlý olarak bakýlmýþ ve elde
edilen bulgular istatistiksel olarak deðerlendirilmiþtir.
Protez kaide materyalleri, uzun süreli
olarak gingival dokularla temastadýr. Bu
temas sonucu, materyal ve doku arasýnda
element salýnýmý oluþmaktadýr. Element
salýnýmý, tükrük ile dilüe edilemeyeceði
için yüksek konsantrasyona ulaþabilmektedir. Böylelikle bað dokusu hücreleri
mukoza üzerindeki protez kaide materyallerinin kimyasal etkilerine direkt olarak
maruz kalmadýðý halde, zaman içinde
difüzyon ile etkilenebilmektedir. Diþeti
bað dokusunun içerisinde çeþitli hücre
elementleri bulunmaktadýr. Bunlar fibroblastik hücreler ile lenfositler, plazma
hücreleri, farklýlaþmamýþ mezankim
hücreleri ve seyyar hücrelerdir. Gingival
fibroblastlar, diþeti dokularýnýn en fazla
kýsmýný oluþturmaktadýr. Bu nedenlerden
dolayý, çalýþmamýzda gingival fibroblastlarýn kullanýlmasý tercih edilmiþtir.
MTT test yöntemi, ilk olarak
Mosmann tarafýndan kullaným alanýna
sokulmuþtur (9). Hücre canlýlýðýný ve
üremesini ölçen bu yöntemin, diðer sitotoksik test yöntemlerine göre daha hassas
ve tekrarlanabilir olmasý, uygulamasýnýn
kolay, hýzlý ve sayýlabilir olmasý avantaj
olarak belirtilmiþtir. Arjan ve ark., MTT
test yönteminin sitotoksisitenin belirlenmesinde kullanýþlý, hassas ve hýzlý bir
metod olduðunu, ayrýca radyoaktif izotop
kullanmaya gerek kalmadýðýný belirtmiþlerdir (10). Wilson ve ark., MTT'den
üreyen formazonun yoðunluðunun
direkt olarak yaþayan hücrelerin sayýsýyla
baðlantýlý olduðunu ileri sürmüþlerdir
(11). Bu yöntemi, kanserli hastalarýn
tedavisinde kullanýlan ilaçlar üzerinde
denemiþler ve elde ettikleri klinik
sonuçlarýn, MTT sonuçlarýyla paralel
olduðunu belirtmiþlerdir. Schauer ve ark.,
MTT yönteminin immün yetmezliði
olan veya immünsüpresif ilaç alan hastalarda T hücrelerinin fonksiyonel analizinde klinik olarak kullanýlabileceðini
ileri sürmüþler ve sonuç olarak, bu yöntemin immün yetmezliði olan hastalarda
deðiþimleri belirlemede uygun bir yöntem olduðunu savunmuþlardýr (12).
Sitotoksisite çalýþmalarýnda güvenilir, hýzlý ve tekrarlanabilir sonuçlar vermesi nedeniyle, bu çalýþmamýzda MTT test yöntemi tercih edilmiþtir.
Hensten-Petterson ve Wictorin, kimyasal olarak polimerize olan rezinlerin,
ýsýyla polimerize olanlara göre daha toksik
olduðunu bildirmiþlerdir (13). Sheridan
ve ark. ýsý ile polimerize olan, kimyasal
olarak polimerize olan ve mikrodalga ile
polimerize olan akriller üzerinde araþtýrmalar yapmýþlar ve en yüksek toksisiteye
kimyasal olarak polimerize olan akrillerin,
en az toksisiteye de mikrodalga ile
polimerize olan akrillerin neden olduðunu saptamýþlardýr (14). Kimyasal olarak
sertleþen akrillerin ýsý ve mikrodalga akrillerine göre daha fazla formaldehid ve
metil metakrilat salgýlayarak sitotoksisiteye neden olduklarý iddia edilmiþtir
(15,16). Çalýþmamýzda elde edilen sonuç-
lar, daha önce yapýlan bu çalýþmalarýn
sonuçlarý ile paralellik göstermekte olup,
en fazla toksisite kimyasal olarak polimerize olan akrilde ve en az toksisite ise
mikrodalga akrilinde bulunmuþtur. Iþýnla
sertleþen akrilin toksisitesi, mikrodalga
akrilinin toksisitesine yakýn çýkmýþtýr.
Enjeksiyon akrilinin toksisitesi ise, ýsý ile
sertleþen akrilin toksisitesinden daha iyi
çýkmýþtýr. Sonuç olarak polimerizasyon
yöntemleri birbirleriyle karþýlaþtýrýldýðýnda, ýsý ve kimyasal olarak sertleþen akrillerin, diðer test örneklerine göre istatistiksel olarak farklýlýklar gösterdikleri görülmektedir. Çalýþmamýzýn sonuçlarý, farklý
protez kaide maddelerinin ve bunlara
uygulanan polimerizasyon yöntemlerinin
gingival dokuya karþý farklý oranlarda toksik olabileceklerini göstermektedir. Bununla birlikte polimerizasyon tipinin,
protez akriliðinin fiziksel özellikleri üzerine olan etkilerinin önemli olabileceði de
göz önüne alýnmalýdýr.
Türkiye’nin ilk İşletme Fakültesi olan İstanbul Üniversitesi İşletme Fakültesi bir ilke daha imza atmaya hazırlanıyor. Arastirmax.com "1. Liselerarası İşletme ve Ekonomi Proje Yarışması"nın sponsorlarından biri olmaktan gurur duymakta.